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合作文章丨Biomoleculars：中大五院揭示胰腺癌低氧脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的分子分型

發(fā)布時(shí)間：

2023-07-28 15:40:18

來自中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腫瘤中心的曾林涓團(tuán)隊(duì)通過使用基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS）技術(shù)的非靶向代謝組學(xué)等研究手段，結(jié)合生物信息學(xué)方法分析，探討了低氧微環(huán)境下PDAC脂質(zhì)代謝的表達(dá)模式，根據(jù)HIF-1途徑和參與鞘脂過程的基因確定了有助于制定針對胰腺導(dǎo)管腺癌患者代謝特征的潛在個(gè)性化治療方案以及脂質(zhì)代謝和缺氧相關(guān)的預(yù)后亞型。相關(guān)成果發(fā)表在期刊Biomoleculars（IF：6.06）上。唯譽(yù)智合科技（Verygenome Technology ）為本研究提供了轉(zhuǎn)錄組、脂質(zhì)組和代謝組學(xué)檢測的技術(shù)支

脂質(zhì)代謝異常通常發(fā)生在缺氧微環(huán)境下，是癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的重要能量補(bǔ)充途徑。為了確定可用于PDAC（pancreatic ductal adenocarcinoma，胰腺導(dǎo)管腺癌）預(yù)后和治療的分子分型的生物標(biāo)志物，探索與缺氧相關(guān)的胰管腺癌的脂質(zhì)代謝特征和基因表達(dá)特征，來自中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院腫瘤中心的曾林涓團(tuán)隊(duì)通過使用基于超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS）技術(shù)的非靶向代謝組學(xué)等研究手段，結(jié)合生物信息學(xué)方法分析，探討了低氧微環(huán)境下PDAC脂質(zhì)代謝的表達(dá)模式，根據(jù)HIF-1途徑和參與鞘脂過程的基因確定了有助于制定針對胰腺導(dǎo)管腺癌患者代謝特征的潛在個(gè)性化治療方案以及脂質(zhì)代謝和缺氧相關(guān)的預(yù)后亞型。相關(guān)成果發(fā)表在期刊Biomoleculars（IF：6.06）上。唯譽(yù)智合科技（Verygenome Technology ）為本研究提供了轉(zhuǎn)錄組、脂質(zhì)組和代謝組學(xué)檢測的技術(shù)支持。

以下為本文研究方法介紹。

PDAC中氧化水平變化和脂質(zhì)降解代謝途徑變化的鑒定

為了鑒定基因表達(dá)的變化，作者分別篩選了GSE28735和GSE62452中的差異表達(dá)基因（DEG），以及正常組織和PDAC組織對，DEG比對的結(jié)果以火山圖顯示。在兩個(gè)數(shù)據(jù)集之間，302個(gè)DEG發(fā)生重疊。使用GO功能富集和KEGG途徑分析進(jìn)一步檢查生物學(xué)功能，多個(gè)GO富集結(jié)果表明DEG與缺氧和脂質(zhì)代謝有關(guān)；此外，KEGG通路分析表明，相關(guān)途徑包括脂肪消化和吸收和脂質(zhì)代謝。結(jié)合以上結(jié)果可知，PDAC表現(xiàn)出組織氧化水平變化和脂質(zhì)代謝方面的一些變化，主要是降解代謝途徑方面。

基于LC-MS的代謝組學(xué)分析及常氧和低氧培養(yǎng)的代謝組學(xué)差異分析

為了進(jìn)一步了解細(xì)胞水平上代謝物的變化，作者選擇了兩種類型的PDAC細(xì)胞系進(jìn)行了研究。首先，使用CoCl2在兩種細(xì)胞系PANC-1和CFPAC-1中分別構(gòu)建了體外缺氧模型，然后通過增加HIF-1α蛋白的表達(dá)來證實(shí)缺氧的充分誘導(dǎo)。

作者分別使用LC-MS（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀）對正?；蚰M缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞的樣品進(jìn)行代謝組學(xué)分析。共鑒定出266種代謝物，其中164種代謝物被鑒定為富集代謝物，102種未被富集。熱圖表明，在兩種細(xì)胞系中，許多代謝物都發(fā)生了強(qiáng)烈的變化。缺氧時(shí)，代謝物如磷脂酰膽堿和磷酸乙醇胺同時(shí)升高，它們可能干擾甘油磷脂代謝；而高強(qiáng)度增殖的癌細(xì)胞需要大量的甘油磷脂用于膜的生產(chǎn)。在兩種類型的細(xì)胞系中，參與組氨酸代謝的物質(zhì)在缺氧條件下均被下調(diào)。組氨酸的攝入和代謝顯示會影響癌細(xì)胞對甲氨蝶呤的敏感性。單磷酸腺苷、L-肉堿、甘油磷酸膽堿和1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-PC等代謝物發(fā)生了變化，導(dǎo)致SMPDB中極長鏈脂肪酸的β氧化和支鏈脂肪酸氧化等脂質(zhì)代謝效應(yīng)受到抑制。

聚焦于HIF-1α的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)分析

為了獲得更精確和更深入的分析結(jié)果，作者從TCGA下載了PDAC患者的數(shù)據(jù)集。HIF-1α被認(rèn)為是缺氧環(huán)境的核心。對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可知186例患者中共有5874個(gè)基因與HIF-1α存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（qvalue<0.05）和正相關(guān)（Spearman系數(shù)>0）關(guān)系。排名前20位的基因如下圖a所示。通過KEGG數(shù)據(jù)庫對上述基因進(jìn)行進(jìn)一步富集途徑分析，最終富集得到122條KEGG途徑。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌感染獲得了較高的富集分?jǐn)?shù)。而根據(jù)之前的研究，在缺氧條件下，中性粒細(xì)胞殺死細(xì)菌的能力可能受損。這一結(jié)果可能解釋了為什么金黃色葡萄球菌感染受到顯著影響，并被認(rèn)為是癌癥患者發(fā)病率和死亡率的重要原因；癌癥發(fā)展過程中細(xì)胞粘附的關(guān)鍵步驟之一似乎也與HIF-1α的變化有關(guān)。

此外，還有一些與脂質(zhì)相關(guān)的途徑，如鞘脂在癌癥的細(xì)胞死亡、存活和治療抵抗中發(fā)揮重要作用。作者通過使用Kaplan–Meier生存分析結(jié)合正相關(guān)基因結(jié)果的批量篩選，顯示了TCGA數(shù)據(jù)集中與PDAC患者OS有顯著關(guān)聯(lián)的504個(gè)基因，發(fā)現(xiàn)這些基因蛋白表達(dá)相對較高和較低的患者的存活時(shí)間有差異。以上均為導(dǎo)致PDAC患者生存率低的因素。作者通過GEPIA2分析PDAC中基因的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)252個(gè)基因具有顯著性。使用多個(gè)篩選基因，KEGG中鞘脂信號通路顯示出顯著的差異富集，重疊基因?yàn)?/span>GNAI3、KRAS、NRAS、MAPK1、SGMS2和PPP2R5E。該代謝途徑中交叉基因的mRNA表達(dá)水平和Kaplan-Meier生存分析（GNAI3、KRAS、NRAS、MAPK1、SGMS2和PPP2R5E）如圖S1c、d所示。由于KRAS和NRAS突變被認(rèn)為是PDAC的內(nèi)在特征，作者又檢測了兩個(gè)PDAC系中其他四個(gè)基因的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)低氧培養(yǎng)顯著增加了參與鞘磷脂信號通路過程的GNAI3、MAPK1、SGMS2和PPP2R5E的表達(dá)。以上結(jié)果可顯示其中的關(guān)聯(lián)性。

HIF-1和鞘脂基因鑒定的PDAC亞型

作者整合了來自多個(gè)PDAC數(shù)據(jù)集的RNA序列數(shù)據(jù)，包括TCGA PAAD、GSE71729、ICGC PACA-CA和PACA-AU。排除非PDAC樣本和無臨床信息特征的樣本后，共有563名患者留在最終的樣本中。作者選取了屬于KEGG基因集HIF-1信號通路（hsa04066）的基因（n=109），GO基因集SPHINGOLIPID METABLIC PROCESS（GO:0006665）（n=162）用于無監(jiān)督聚類分析。該方法結(jié)合了來自不同實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，提高了所有數(shù)據(jù)集的共同特征的可信度，并揭示了其中的重要特征。作者通過相應(yīng)的累積分布函數(shù)（CDF）曲線和三角面積圖（K=3），對合并的數(shù)據(jù)集應(yīng)用無監(jiān)督聚類法，將PDAC聚類為三個(gè)子類型（如下圖a）。合并數(shù)據(jù)中聚類1、2、3的病例的占比分別為10.48%、32.5%、57.02%。主成分分析（PCA）（如下圖b）表明，各組可以成功地根據(jù)特征亞型分類對樣本進(jìn)行區(qū)分和分類。此外，作者還調(diào)查了三個(gè)類型的預(yù)后。生存曲線表明，類型1中的樣本的生存時(shí)間總是較短，以天為單位，而類型2預(yù)測的生存時(shí)間最長?？傮w而言，與類型1相似的類型3的生存結(jié)果較差（如下圖c）。結(jié)果表明，PDAC中存在低氧脂質(zhì)代謝亞型，并伴有不同的預(yù)后情況。

突變特征的分布及與其他PDAC亞型的關(guān)聯(lián)

代謝亞組中HIF-1和鞘脂基因的表達(dá)水平的熱圖表明，集群中mRNA表達(dá)之間存在細(xì)微差異。此外，作者分析了不同組間參與HIF-1信號通路的基因的變化。與類型2相比，類型3的相關(guān)基因變化更多（如下圖a）；BCL-2蛋白可以控制細(xì)胞死亡，并在類型3中發(fā)生顯著變化；RELA作為低氧反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在類型1和類型3中，與類型2相比有所增加；ELOVL1、SMPD3和DEGS1參與鞘脂代謝過程，并實(shí)現(xiàn)類型1和3中的升高。

基因表達(dá)分析顯示，類型3中HIF1α相關(guān)基因P4HA1的表達(dá)增加，類型1中鞘脂信號基因SPHK1和SPHK2的表達(dá)增加。為了尋找與集群中mRNA表達(dá)相關(guān)的被影響途徑，作者進(jìn)行了綜合分析，包括差異表達(dá)分析和功能富集。篩選的基因顯示了功能的顯著差異?？梢娤卤?。

在體細(xì)胞變化中，最常見的驅(qū)動基因（KRAS、CDKN2A、TP53和SMAD4）仍處于最高位。類型2中MUC16突變的變異明顯高于類型1和類型3亞組（如下圖b）。先前的研究表明，MUC16基因的突變數(shù)與TMB（tumor mutational burden，腫瘤突變負(fù)荷）密切相關(guān)，而MUC16高突變數(shù)與更好的OS（overall survival，總體生存率）相關(guān)。在先前的研究中，存在與生存率相關(guān)的PDAC基因表達(dá)亞型，如basal-like型和squamous型的預(yù)后較差。作者為了研究上述的分類和以前的類型之間的關(guān)系，于是將樣本分為不同的亞型，并分析每個(gè)類型的組成（如下圖c）。結(jié)果較差的1組和3組分別包括basal-like型病例（59.32%；82.86%）和squamous型病例（38.98%；34.57%）。存活時(shí)間較長的類型2大部分為經(jīng)典樣本（63.93%），而basal-like型（36.1%）和squamous型（4.37%）樣本較少。結(jié)果表明，與低氧脂質(zhì)代謝相關(guān)的途徑可以幫助我們識別具有不同預(yù)后的PDAC亞型。

總結(jié)

作者通過對不同表達(dá)基因的富集分析，發(fā)現(xiàn)PDAC中存在異常的脂質(zhì)代謝和氧變化。兩種PDAC細(xì)胞的非靶向代謝組學(xué)分析清晰地指向HIF-1α蛋白相關(guān)代謝物；通過確定可能在缺氧環(huán)境中受到干擾的代謝物，分析了可能受到影響的許多脂質(zhì)代謝途徑；通過多重分析，完成了在TCGA PDAC數(shù)據(jù)中，與HIF-1α呈正相關(guān)的基因鑒定；使用篩選出的基因補(bǔ)充了鞘脂信號通路；根據(jù)HIF-1途徑和鞘脂過程的基因，確定了三個(gè)亞型（類型），并發(fā)現(xiàn)亞型與患者不同的存活率相關(guān)，第2組患者比其他組患者有顯著的生存優(yōu)勢。

原文鏈接：https://www.mdpi.com/2218-273X/12/10/1533

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